GAP-43,BIM人生長相關蛋白43 ELISA試劑盒

l 本試劑盒用(yong)于體外定量(liang)檢(jian)測血清、血漿、組織、細胞上清及相關液(ye)體樣本中人生長相關蛋白43（GAP-43）的含量。

l 有效期：6個月

l 保存條件(jian)：2-8℃

l 本試劑盒僅供體外研(yan)究使(shi)用，不用于臨(lin)床診斷

實驗原理

試劑盒采用(yong)雙(shuang)抗(kang)體(ti)(ti)一步(bu)夾心(xin)法(fa)酶(mei)聯免(mian)疫吸附試驗(yan)（ELISA）。往預先包(bao)被人生(sheng)長(chang)相關蛋(dan)白43（GAP-43）捕(bu)獲抗(kang)體(ti)(ti)的(de)(de)包(bao)被微孔(kong)中，依次加入標本、標準品、HRP標記的(de)(de)檢(jian)測(ce)抗(kang)體(ti)(ti)，經過溫育并*洗滌(di)。用(yong)底物(wu)TMB顯色(se)(se)，TMB在(zai)過氧化(hua)(hua)物(wu)酶(mei)的(de)(de)催化(hua)(hua)下轉化(hua)(hua)成(cheng)藍色(se)(se)，并在(zai)酸的(de)(de)作(zuo)用(yong)下轉化(hua)(hua)成(cheng)zui終的(de)(de)黃色(se)(se)。顏色(se)(se)的(de)(de)深(shen)淺和(he)樣品中的(de)(de)人生(sheng)長(chang)相關蛋(dan)白43（GAP-43）呈正相關。用(yong)酶(mei)標儀在(zai)450nm 波長(chang)下測(ce)定吸光度（OD 值(zhi)），計(ji)算樣品濃度。

樣本處理及要求

1.  血清：全血標本請(qing)于(yu)(yu)室(shi)溫(wen)放(fang)(fang)置2小時或4℃過一夜后于(yu)(yu)1000g離心20分鐘，取(qu)上清即可(ke)檢測，或將標本放(fang)(fang)于(yu)(yu)-20℃或-80℃保存(cun)，但(dan)應避免反復凍融。
2.  血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑(ji)，標(biao)本采集(ji)后30分鐘(zhong)內于2 - 8°C 1000g離心20分鐘，或將(jiang)標本放(fang)于-20℃或-80℃保(bao)存，但應避免反復凍(dong)融。

3.  組織勻漿：用(yong)預冷的(de)(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織(zhi)，去除殘留血液（勻(yun)漿(jiang)中裂解的(de)(de)紅(hong)細(xi)胞(bao)會影(ying)響測(ce)量(liang)結(jie)果），稱重(zhong)后將組織(zhi)剪(jian)(jian)碎。將剪(jian)(jian)碎的(de)(de)組織(zhi)與對(dui)應體積(ji)的(de)(de)PBS（一般按(an)1:9的(de)(de)重(zhong)量(liang)體積(ji)比，比如1g的(de)(de)組織(zhi)樣品對(dui)應9mL的(de)(de)PBS，具體體積(ji)可(ke)根(gen)據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻(yun)漿(jiang)器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織(zhi)細(xi)胞(bao)，可(ke)以對(dui)勻(yun)漿(jiang)液進行超聲(sheng)破碎，或反復凍(dong)融。zui后將勻(yun)漿(jiang)液于5000×g離(li)心5~10分鐘，取上清檢測(ce)。

4.  細(xi)胞(bao)培養(yang)物(wu)上清或其它生物(wu)標本：1000g離心20分鐘，取上(shang)清(qing)即(ji)可檢測(ce)，或(huo)將標本(ben)放于-20℃或(huo)-80℃保存，但應避免反復凍融。
注：標本(ben)溶(rong)血(xue)會(hui)影(ying)響zui后(hou)檢(jian)(jian)測(ce)結果，因此溶(rong)血(xue)標本(ben)不宜進行此項(xiang)檢(jian)(jian)測(ce)。

標(biao)本處理

1.  本(ben)公司只對試劑(ji)盒(he)本(ben)身負(fu)責(ze)(ze)，不對因使用(yong)該試劑(ji)盒(he)所(suo)造成的樣本(ben)消耗負(fu)責(ze)(ze)，請使用(yong)者使用(yong)前充分考(kao)慮到樣本(ben)的可能使用(yong)量，預(yu)留(liu)充足的樣本(ben)。

2.  實驗前應預測標(biao)本(ben)(ben)(ben)含量(liang)，如果標(biao)本(ben)(ben)(ben)濃(nong)度(du)過高，應對標(biao)本(ben)(ben)(ben)進行稀(xi)釋，使(shi)稀(xi)釋后的標(biao)本(ben)(ben)(ben)符合試劑盒的檢測范(fan)圍，計(ji)算時再乘以相應的稀(xi)釋倍數(shu)。標(biao)本(ben)(ben)(ben)使(shi)用0.01mol/L的PBS稀(xi)釋(PH=7.0-7.2)。

3.  若所檢樣(yang)本不(bu)包(bao)含在(zai)說明(ming)書(shu)所列樣(yang)本之中，建議(yi)進(jin)行預實驗(yan)驗(yan)證其有效性，并注(zhu)意留存樣(yang)本。

4.  使用化(hua)學裂解液(ye)制備的組織勻(yun)漿或細胞提取液(ye)可(ke)能(neng)會由于某(mou)些化(hua)學物質的引入導致ELISA實(shi)驗結果偏差。

5.  若樣本(ben)為細胞(bao)(bao)培養上清，因該類樣本(ben)干擾(rao)因素較多(duo)，如：細胞(bao)(bao)狀態、細胞(bao)(bao)數量、采(cai)樣時間(jian)等，所以可(ke)能存在檢(jian)測(ce)不出的情況。

6.  某些天(tian)然蛋白(bai)或重組蛋白(bai)，包(bao)括原核及真核重組蛋白(bai)，可能因為與本(ben)產品所使(shi)用的檢測抗(kang)體及捕獲抗(kang)體不(bu)匹(pi)配，而不(bu)被(bei)檢測出。

7.  建(jian)議使用新鮮(xian)樣本(ben)，保存(cun)時間過長可能(neng)會存(cun)在(zai)蛋白降解或變性導致實驗結果偏差。

需要而未提(ti)供的試(shi)劑和器材

• 酶(mei)標儀（450nm）
• 高(gao)精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
• 37℃恒溫箱(xiang)
• 蒸餾(liu)水或(huo)去離子水

試(shi)劑(ji)盒組(zu)成

備注(zhu)：

1.  標(biao)準品(pin)濃(nong)度依次為(wei)：480、240、120、60、30、0 pg/mL

2.  經過大量正常標本檢驗(yan)，標本的正常濃度值(zhi)均在試劑盒提(ti)供的檢測范圍內，實驗(yan)過程中直接(jie)取50μL樣(yang)(yang)本上樣(yang)(yang)即可。當(dang)有部分樣(yang)(yang)本值超過(guo)zui大標準(zhun)品濃(nong)度(du)時，可用樣(yang)(yang)本稀釋液將標本進行(xing)適當(dang)稀釋后再進行(xing)實驗。

注意事項(xiang)

• 嚴(yan)格按照規定的時間(jian)和(he)溫度(du)進(jin)行溫育以(yi)保(bao)證準確結果。所有試(shi)劑都必須在使(shi)用(yong)前達到室溫20-25℃。使(shi)用(yong)后立即冷藏保(bao)存試(shi)劑。
• 洗板不正確(que)(que)(que)可以導致不準確(que)(que)(que)的結果。在(zai)加入底物前(qian)確(que)(que)(que)保(bao)盡量吸(xi)干(gan)孔內(nei)液體。溫育過程中不要讓微孔干(gan)燥掉(diao)。
• 消除板底殘留(liu)的(de)液體和手指印，否(fou)則影響OD值。
• 底(di)物顯色液(ye)應呈無色或很淺的(de)顏色，已經(jing)變藍的(de)底(di)物液(ye)不能使用。
• 避(bi)免試劑和標本的交叉污(wu)染以免造成錯(cuo)誤結果。
• 在(zai)儲(chu)存和溫(wen)育(yu)時避免強光直接照射。
• 平衡(heng)至室溫后再打開密封袋以防水滴(di)凝聚在冷板條(tiao)上。
• 任(ren)何反應(ying)(ying)試(shi)劑(ji)不能(neng)接(jie)觸(chu)漂(piao)白溶劑(ji)或(huo)漂(piao)白溶劑(ji)所散(san)發(fa)的強烈氣(qi)體。任(ren)何漂(piao)白成分都(dou)會破壞試(shi)劑(ji)盒(he)中反應(ying)(ying)試(shi)劑(ji)的生物活性。
• 不能使用過(guo)期產品。
• 如(ru)果(guo)可能傳(chuan)播疾病，所有的樣品都(dou)應管(guan)理好，按照規定(ding)的程序處理樣品和檢測裝置。

試劑(ji)準備

試(shi)劑盒從冷藏(zang)環境中(zhong)取(qu)出應在室溫平(ping)衡后(hou)方可使用(yong)。

20×洗(xi)(xi)滌緩(huan)沖液的稀釋(shi)：蒸(zheng)餾水按1：20稀釋(shi)，即1份(fen)20×洗(xi)(xi)滌緩(huan)沖液加19份(fen)蒸(zheng)餾水。

操作(zuo)步驟

1.  從(cong)室溫平衡20min后的鋁箔袋(dai)中取出所需板(ban)條，剩余板(ban)條用(yong)自封袋(dai)密封放回4℃。

2.  設置標準品(pin)孔(kong)和樣本(ben)孔(kong)，標準品(pin)孔(kong)各加不同(tong)濃度的標準品(pin)50μL；

3.  樣本(ben)孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。

4.  除空白孔外，標準品孔和樣本(ben)孔中每孔加入辣根(gen)過氧(yang)化物酶(mei)（HRP）標記(ji)的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(ying)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.  棄去液體，吸水紙上拍干，每(mei)孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩(shuai)去(qu)洗滌液，吸(xi)水(shui)紙上拍干，如此重復洗板(ban)5次（也可用洗板(ban)機洗板(ban)）。

6.  每(mei)孔加入底物A、B各50μL，37℃避光(guang)孵(fu)育15min。

7.  每孔加(jia)入終止(zhi)液50μL，15min內，在450nm波長處測(ce)定各孔的OD值。

實驗結果計算

以所(suo)測標準(zhun)品的OD值為橫(heng)坐(zuo)標，標準品的濃度值為(wei)縱(zong)坐標(biao)，在(zai)坐標(biao)紙上或(huo)用相關軟(ruan)件(jian)繪制標準曲線，并得到直(zhi)線回歸(gui)方程，將樣(yang)(yang)品(pin)的OD值代入方(fang)程，計算出樣(yang)(yang)品(pin)的濃度。

試劑盒(he)性能

1.  檢測范圍：15 pg/mL – 480 pg/mL。

2.  靈敏(min)度(du)：zui低檢測(ce)濃度(du)小(xiao)于1.0 pg/mL。

3.  特異性：不(bu)與其(qi)它可溶(rong)性結構(gou)類似物交叉反應。

4.  重(zhong)復性：板(ban)內(nei)變(bian)異(yi)系數小于10% ，板(ban)間變異系數小于15% 。

說明

1.  由于現有條件(jian)及科(ke)學技術水(shui)平尚不能對所有供(gong)貨商提供(gong)的所有原(yuan)料進(jin)行全面(mian)的鑒(jian)定與分(fen)析(xi)，本產品可(ke)能存在一(yi)定的質(zhi)量(liang)技術風險(xian)。

2.  zui終(zhong)的實(shi)驗(yan)結果與試(shi)劑的有(you)效性、實(shi)驗(yan)者的相(xiang)關操作(zuo)以及(ji)當時的實(shi)驗(yan)環境密切(qie)相(xiang)關，請務必準備充足的標本(ben)備份。

3.  不同(tong)批次的同(tong)一產品可能會有少許(xu)差別，如：檢(jian)測限、靈敏度以及顯色(se)時間等，請依據試劑盒內說(shuo)(shuo)明(ming)書(shu)進行實驗操作(zuo)，電子版說(shuo)(shuo)明(ming)書(shu)僅作(zuo)參考。

4.  只有(you)全部使(shi)用(yong)本(ben)試(shi)劑盒配套試(shi)劑才能(neng)保(bao)證檢測(ce)(ce)效果，不能(neng)混用(yong)其他商(shang)的(de)產品。只有(you)嚴格(ge)遵(zun)守本(ben)試(shi)劑盒的(de)實(shi)驗說明才會得到(dao)的(de)檢測(ce)(ce)結果。

問題(ti)解答

若實(shi)驗效果(guo)不好，請(qing)及時對顯色結(jie)果(guo)拍照，保留所用(yong)板條及未使(shi)用(yong)試劑，并妥善保存，然后我公司為(wei)您(nin)(nin)解決問題。同時您(nin)(nin)也(ye)可以參考(kao)以下(xia)資(zi)料(liao)：